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Viaje al centro de la placa de petri


Un vistazo a los análisis de patógenos


En los medios y el entretenimiento tanto los “químicos” como los “microbios” tienen una connotación peyorativa; sin embargo, las emociones e impresiones que provocan son bastante diferentes: unos intoxican, envenenan y su símbolo más usual es la máscara de gases proveniente de series de guerra o distópicas; los otros infectan, enferman y se asocian a camillas, sueros y otros elementos típicos de las series médicas. Ambos son susceptibles de analizarse y cuantificarse, pero definitivamente el factor viviente cambia las reglas con las que se analizan las muestras. A continuación veremos algunas particularidades de los análisis protagonizados por microorganismos:

Prestos y delicados a la vez

Haciendo honor del “se reproducen” proveniente de la descripción escolar de los seres vivos, los microorganismos tienen el potencial particular se esparcirse y multiplicarse en una muestra poco contaminada, limitando severamente el tiempo de vida en el que una muestra mantiene sus condiciones originales: al mismo tiempo, el “mueren” ocasiona que conservarlos con vida pueda ser todo un reto, y que se requieran ciertas condiciones o aditivos necesarios para que se encuentren tan listos y dispuestos a desarrollar un resultado positivo como lo están para causar esas molestas intoxicaciones alimentarias.

Esta combinación de invasividad y delicadeza influye en los aspectos diversos de su estudio.

En cantidades grandes e indistintas

Los números que se manejan al hablar de microorganismos pueden llegar a ser del orden de los millones por gramo o mililitro para bacterias abundantes en reservorios naturales. Si añadimos a esto una tasa de reproducción sumamente variable y veloz en las condiciones favorables encontramos que, al tratar de microorganismos, es poco realista esperar una precisión de análisis comparable a la de sustancias inorgánicas, las cuales pueden permanecer fácilmente invariables si las condiciones externas también lo son. Un periodo de minutos, una diferencia de temperatura de pocos grados o unos gramos adicionales de nutrientes pueden significar la diferencia de un ciclo de replicación de más o de menos que duplica o divide la población microbiana a la mitad. Aunque los métodos mantienen composiciones de medios de cultivo, temperaturas de incubación y unos tiempos estrictos, por la naturaleza inherentemente exponencial del crecimiento microbiano la variación relativa de los resultados de análisis puede ser un porcentaje elevado o incluso estar a la par con el valor absoluto del resultado.

Ya que los microorganismos pueden reproducirse y alcanzar niveles detectables o infecciosos con relativa independencia de su cantidad inicial, algunos métodos de análisis y normas regulatorias optan por manejar el resultado en meros términos de presente o ausente. En esta línea, se convierte en fundamental la cantidad original de muestra que se evalúa, ya que una mayor cantidad tiene mayor probabilidad de presentar un microorganismo; por este motivo, la expresión de muchos resultados microbiológicos se exprese en términos como “UFC (unidades formadoras de colonias)  / 25 g”. No se espera que se ejecute la división en estas expresiones, ya que el denominador expresa en forma crítica la cantidad original de la que se partió para detectar y cuantificar microbios.

Dar tiempo

Los microorganismos pueden tomar desde unos 20 minutos a días enteros en replicarse. Dado que los métodos tradicionales se basan en que éstos proliferen en los medios de cultivo en los que se siembran, necesariamente han de ir a su paso. No es posible “espolear” los microorganismos para obtener resultados más rápido como no es posible para un niño convertirse en adulto de la noche o la mañana, por más que lo desee para gozar de esas libertades. Incluso para una bacteria con capacidad de reproducción veloz, convertirse desde menos de una mota de polvo hasta una colonia de varios milímetros de diámetro le tomará unos días, por lo que los métodos microbiológicos clásicos suelen requerir varios días para emitir un resultado final.

Partida: del plato a la bolsa estéril

Muestra de alimento
Muestra en su bolsa estéril

Teniendo en mente lo comentado anteriormente, podemos evaluar la travesía de los microorganismos de una muestra a lo largo de las diversas pruebas del laboratorio:

Comencemos por un alimento contaminado: un producto quizá insuficientemente cocido que alberga algunos ejemplares de la célebre Salmonella enterica. Esta bacteria se encuentra dispuesta a causar diarrea, torzones, fiebre y otras molestias al comensal incauto y es capaz de dejarlo en cama uno o dos días; sin embargo, esta vez la porción de comida ha sido interceptada por un muestreador y se dirige en una bolsa estéril, dentro de una hielera, a las instalaciones de un laboratorio acreditado.

Terapia y reposición

Idealmente, querríamos colocar inmediatamente un poco de muestra directamente sobre el agar y observar a las bacterias formar una colonia que nos permita concluir indudablemente que las Salmonella enterica se encontraban en el alimento bajo sospecha. En la realidad, hay una serie de pasos que hace falta realizar antes y después de esta siembra para poder llegar a estas conclusiones.

Suelo con sodicidad alta
Las muestras se incuban inmersas en un medio de enriquecimiento

Para empezar, los bacilos probablemente se encuentran en un número reducido y en un estado debilitado producto del proceso de preparación del alimento; en estas condiciones, podrían no formar colonia alguna o tomarles demasiado tiempo para ello. Para poder devolverlos a sus condiciones óptimas, se inicia con la etapas de enriquecimiento.

En el enriquecimiento, el alimento se sumerge en un caldo de cultivo lleno de nutrientes fácilmente asimilables, de manera que los microorganismos pueden alimentarse de él y reproducirse, facilitando los cultivos siguientes. Aquí existe otro problema: un alimento contaminado no sólo contendrá la especie patógena en cuestión, sino muchas otras especies de microorganismos que pueden superarla en número y competir por los nutrientes, obstaculizando su detección. Por este motivo se pasa al enriquecimiento selectivo, usando una fuente de alimento que sólo pueden aprovechar los microbios objetivo o adicionando un agente que inhibe el crecimiento de los demás.

Nuestras salmonelas de la muestra serán sumergidas en un caldo nutritivo general por 18 horas. De este medio se tomará una pequeña porción que será transferida a dos caldos selectivos por por 24 h en los cuales podrá crecer libre, minimizando la interferencias de otros microorganismos. Tiempo de análisis: 42 h

Hora de dejar huella

Una vez que se tiene un caldo de enriquecimiento incubado y rebosando de bacterias, es el momento de aislarlas en colonias individuales y homogéneas en las que se puede confiar que proceden de una sola especie y cepa de patógeno: en este paso se usan medios de agar sólido en los cuales las bacterias permanecen relativamente inmóviles en el lugar en el que se sembraron y crecen en colonias diferenciables. Hay varias formas de colocar la muestra o su extracto en el agar: se puede verter el líquido y esparcirlo o mojar un asa y pasarla sobre el medio. Ya que es imposible decir con certeza si una colonia proviene de una sola bacteria o varias que convergieron, las mediciones cuantitativas que se realizan aquí se reportan como unidades formadoras de colonias (UFC).

En nuestro caso, el caldo enriquecido de Salmonella será sembrado en medios sólidos por hasta 48 h para obtener estas colonias. Estos medios tienen ingredientes que ocasionan cambios de color o aspecto apreciables con un grupo de organismos específico. En el agar denominado XLD, las bacterias producirán colonias con centro negruzco. Tiempo de análisis: 90 h

Siembra en placa  Proceso industrial
Tras la siembra, las bacterias desarrollan colonias en el agar

 

Presuntos culpables, al pasillo de los sospechosos

Muestra de alimento
Prueba bioquímica: los tubos fueron incoculados con el microorganismo patógeno

Terminado el periodo de incubación de las placas, puede haber dos posibilidades: por un lado, podría ocurrir que no creciera ninguna colonia sospechosa sobre los medios. En estos casos el análisis puede darse por terminado y declararse el resultado como negativo o ausente. El interesado recibirá la buena noticia tras sólo 4 días en este caso, aunque no debería darse por hecho desde antes que ingresen que el análisis sólo durará este tiempo o que si se prolonga la mala noticia es inevitable.

En el caso que hayan aparecido colonias que encajen con la descripción, es algo aventurado concluir que existe la presencia de una especie determinada solamente a partir de el color y el aspecto que presentan las colonias sobre el agar. Sigue existiendo un aspecto subjetivo en ello, así que se procede a realizar las pruebas que se denominan confirmativas. De una o varias colonias que se consideran sospechosas se ejecutan ensayos para reacciones bioquímicas diversas, ya que las diferentes especies suelen tener una combinación de reacciones positivas y negativas típicas que las caracterizan: algunas pueden efectuarse en minutos en un tubo de ensayo con reactivos que cambian rápidamente de color, otras se ejecutan en medios de cultivo que pueden tomar otras 24 horas o más en presentar el cambio (o la ausencia de cambio) esperados.

Las colonias sospechosas de Salmonella enterica serán inoculadas primero en un caldo nutritivo general por 24 h y más tarde en dos agares en tubo por 24 h que buscan probar varios de sus hábitos alimenticios, como el consumo anaerobio de glucosa y la producción del sulfuro de hidrógeno. Tiempo de análisis: 138 h.

Una vez confirmados este metabolismo, se sigue con otras pruebas bioquímicas de 24 h de duración y a la par se realizan pruebas serológicas. En estas últimas se añaden anticuerpos hechos para adherirse y aglutinar con antígenos que portan los organismos objetivos.

Existen varios antisueros disponibles que pueden combinarse con las salmonelas y pegarlas unas a otras, generando cúmulos visibles que las identifican de manera similar a las pruebas sanguíneas. Habiendo dado un resultado positivo para las pruebas bioquímicas y serológicas, el informe de resultados declarará que el producto en cuestión efectivamente tenía esta bacteria. Tiempo total: 7 días.

Interrogatorio extenso y pruebas del ADN

En la mayor parte de los casos la confirmación es suficiente para que el organismo regulatorio dictamine la alerta sanitaria. En algunos casos se puede querer saber más, ya sea por propósitos de investigación epidemiológica o resolver algún caso atípico en que algunas cepas mutantes pueden dar alguna prueba bioquímica o serológica irregular.

Puede optarse por varias opciones propias de un “power user”, como un ensayo múltiple que evalúa decenas de reacciones bioquímicas simultáneamente y que por lo tanto permite una caracterización bastante poderosa capaz de distinguir entre varias especies del mismo género.


Prueba bioquímica múltiple
Prueba múltiple. Cada celda corresponde a una reacción bioquímica diferente.

 

La otra opción que puede circundar todo el problema de las siembras, aislamientos y confirmación es recurrir a los métodos genéticos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los cuales pueden ir al meollo del asunto y apuntar a las secuencias de ADN específicas de Salmonella desde el inicio. Tras salir del primer enriquecimiento, los patógenos quedan identificados como un ladrón con los reflectores encima.


Reporte PCR
Un análisis PCR detecta segmentos específicos de ADN y requiere 24 a 36 h en total.

 Tanto la toma de muestras como el análisis de microorganismos tiene sus propios retos. El estar consciente de ello le permitirá planear adecuadamente el análisis de sus productos e integrarlos en su cadena productiva.